siRNA特异性干扰EgRad9基因表达对细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤机制的影响

摘要：目的 研究小干扰RNA (small interfering RNA,siRNA)特异性干扰EgRad9基因表达后对细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤机制的影响. 方法 利用电穿孔法将EgRad9-siRNA干扰序列和阴性对照干扰序列转染细粒棘球蚴原头节,实验分为EgRad9-si RNA-354、-614、-971干扰组,阴性对照组和空白对照组.电转染3d后,加入自然状态下原头节大耐受浓度的H2O2处理1h,伊红染液染色后,倒置荧光显微镜下观察原头节活性并计算存活率.收集各组原头节的培养液,进行碱性磷酸酶活性的检测.电转染3 d后,加入自然状态下原头节耐受H2O2的大耐受浓度处理1h后,TRIzol法提取总RNA.实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测EgRad9mRNA的表达.采用彗星实验检测干扰EgRad9基因表达后细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤情况,活性氧(reactive oxygen species,ROS)检测试剂盒检测干扰EgRad9基因表达后细粒棘球蚴原头节体内ROS的含量,采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析 结果 自然状态下细粒棘球蚴原头节体外耐受H2O2的大浓度为0.4 mmol/L,干预时间为1h;电穿孔法可将绿色荧光干扰序列有效的导入原头节体内,实验组和阴性对照组的原头节体内均有明亮的绿色荧光斑点;而空白对照组原头节体内无绿色荧光斑点.EgRad9-siRNA-354、-614、-971干扰组原头节的存活率分别为(42.99±4.03)％、(29.86±5.87)％和(56.48±4.64)％,初步筛选有效干扰序列为EgRad9-siRNA-614. siRNA-354、-614、-971干扰组碱性磷酸酶活性分别为0.024±0.001、0.004±0.001、0.039±0.002,其中EgRad9-siRNA-614组碱性磷酸酶活性与阴性对照组(0.095±0.001)和空白对照组(0.099±0.001)相比,差异均有统计学意义(t=10.227、10.934,均P＜0.01),表明该组原头节EgRad9基因经干扰后对其活性影响大,有效干扰序列为EgRad9-siRNA-614.EgRad9-siRNA-354、614、971干扰组EgRad9 mRNA表达量分别为0.432±0.055、0.291±0.079、0.612±0.032,其中经EgRad9-siRNA-614序列干扰后,EgRad9 mRNA表达量与阴性对照组(1.001±0.020)和空白对照组(1.001±0.012)相比均显著下调(t=7.874、7.663,均P＜0.01),可确定有效干扰序列为EgRad9-siRNA-614.相同电泳条件下,EgRad9-siRNA-614干扰组原头节DNA碎片离开核向阳极迁移,形成拖尾;EgRad9-siRNA-614干扰组彗星尾距OTM值为13.901±2.263,与阴性对照组(0.074±0.020)和空白对照组(0.047±0.034)相比,差异有统计学意义(t=12.845、13.251,均P＜0.01).经EgRad9-siRNA-614序列干扰后,原头节体内ROS含量为13.024±0.154,与阴性对照组(2.728±0.083)和空白对照组(2.555±0.007)相比,差异有统计学意义(t=9.296、10.134,均P＜0.01). 结论 EgRad9基因在细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤过程中发挥重要作用,EgRad9-siRNA-614干扰片段可特异性干扰EgRad9基因的表达,并降低原头节修复DNA氧化损伤的能力.