热休克蛋白47(HSP47)-短发夹RNA的构建及其细胞水平对HSP47表达的影响

摘要：目的 针对肝纤维化发病关键基因热休克蛋白47 (HSP47)基因构建HSP47-shRNA,初步验证其在NIH/3T3细胞系干预HSP47基因的表达,影响HSP47 mRNA及蛋白水平表达,并观察该细胞功能学变化. 方法 设计HSP47-shRNA模板,并将其分别设计于U6启动子的下游引物,将U6启动子及其下游HSP47-shRNA的模板双链DNA连接入载体,构建HSP47-pGCsi-U6-shRNA重组质粒(HSP47-1-pGC si-U6-shRNA、HSP47-2-pGCsi-U6-shRNA和HSP47-3-pGCsi-U6-shRNA).以非相关干扰质粒作为对照,通过脂质体介导转染HSP47-shRNA至小鼠胚胎成纤维细胞(NIH/3T3)中,分别于12、24、48和72 h在倒置荧光显微镜下观察细胞转染效率和荧光表达强度;同时于转染后0、24和48 h收集细胞,采用RT-PCR和蛋白质印迹(Western blotting)分析HSP47 mRNA和蛋白表达情况;并观察干预后该细胞分泌胶原功能和小鼠转化生长因子(TGF-β1)表达的变化. 结果 成功构建HSP47-shRNA载体,通过脂质体介导转染入NIH/3T3细胞,各干扰质粒转染效率均约为60.0％,各干扰质粒转染效率间差异无统计学意义(P＞0.05).转染12h,可见少量绿色荧光细胞,随转染时间的延长,细胞荧光表达量逐渐增加,各干扰质粒于转染72h荧光表达强.shRNA干扰显著抑制HSP47蛋白的表达,以转染HSP47-1-shRNA 24h后对蛋白表达抑制效果佳,对HSP47 mRNA的相对沉默效率为(25.83±1.79)％,与空白组及非相关对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).HSP47-1-shRNA转染24h,Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA相对表达量分别下调为(56.52±1.64)％和(53.48±2.54)％,转染48 h分别下调为(54.17±2.63)％和(50.21±2.34)％,明显低于空白组和非相关对照组(P＜0.05),但各实验组间差异无统计学意义(P＞0.05).各组HSP47-shRNA干扰质粒对TGF-β1 mRNA的抑制效率以转染24h效果佳,相对表达分别为(63.23±2.18)％、(64.53±3.17)％和(75.19±4.20)％,均低于空白组和非相关对照组(P＜0.01),但干预组间对TGF-β1的抑制率差异无统计学意义(P＞0.05).各HSP47-shRNA干扰质粒组细胞上清中TGF-β1的抑制率以转染24h为佳,分别为(51.79±3.12)％、(66.67±2.13)％和(69.61±3.65)％,与空白组相比,HSP47-1-shRNA组与HSP47-2-shRNA组对TGF-β1均有显著抑制作用,且以HSP47-1-shRNA组抑制效率更佳(P＜0.05),HSP47-3-shRNA组与空白对照组间差异则无统计学意义(P＞0.05). 结论 构建了HSP47-shRNA干扰质粒,初步证实其对HSP47的表达干预有效,并引起NIH/3T3细胞功能学的变化.